Аргинин: биологическое действие, влияние на синтез оксида азота

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя МОЗ Украины

(Представлено чл.-кор. НАН Украины Н.М. Гулой)

Для людей аргинин считается условно незаменимой аминокислотой. Его эндогенный синтез осуществляется главным образом из цитруллина, который синтезируется в слизистой тонкого кишечника как конечный продукт глутаминового / глутаматного метаболизма и током крови почти весь доставляется в почки, где при участии аспартата в цикле мочевой кислоты превращается в аргинин. Последний через почечные вены поступает в циркуляцию и разносится к различным клеткам и тканям организма. Синтез аргинина также возможен из цитруллина, орнитина и пролина, но он выражен слабо [3,22].

Количество аргинина, синтезируемого у взрослого человека (примерно 2 грамма в день), достаточно, чтобы обеспечить его физиологические потребности в нормальных условиях. Значительные количества аргинина расходуются на синтез креатина, который является субстратом креатинкиназной ферментативной системы, ответственной в клетке за депонирование и транспорт энергии в виде КрФ от источников ее образования к местам использования. Взрослый организм в результате спонтанного, без участия ферментов, расщепления ежедневно теряет 1-2 г креатина, на синтез которого требуется 1.75 – 3.5 г аргинина [3,22]. Поэтому для восполнения клеточного фонда креатина, необходимо дополнительное поступление его или аргинина из экзогенных источников.

Аргинин участвует также в синтезе полиаминов (путресцина, спермина, спермидина, агматина и др.), присутствующих во всех клетках в относительно больших, зачастую миллимолярных концентрациях. Особенно много полиаминов синтезируется клетками предстательной железы и выделяется с семенной жидкостью. В настоящее время считается, что полиамины содействуют пролиферации и дифференцировке, ингибируют апоптоз клеток, что, возможно, связано со способностью этих соединений активировать растворимую гуанилатциклазу и повышать уровень цГМФ. Показано влияние полиаминов на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы организма. С одной стороны полиамины проявляют антиоксидантную активность, перехватывая радикалы и способствуя экспрессии соответствующих протекторных белков за счет взаимодействия с ДНК, а с другой – окисление полиаминов приводит к образованию избытка перекиси водорода, который приводит к развитию оксидативного стресса [10].

В процессе декарбоксилирования аргинина образуется агматин. Недавние исследования показали, что агматин может быть нейромедиатором: он синтезируется в мозгу, сохраняется в синаптических везикулах определенных нейронов, высвобождается при деполяризации, связывается α-2-адренорецепторами, блокирует NMDA рецепторные и связывающие другие лиганды катионные каналы, инактивируется агматиназой. Кроме того, агматин ингибирует NO-синтазы и индуцирует высвобождение некоторых пептидных гормонов [24]. Постоянный и довольно значительный расход аргинина в организме идет на синтез NO [9,22], который усиливается в условиях индукции соответствующей NO-синтазы при воспалительных процессах, сепсисе и др. патологиях.

При стрессовых состояниях, связанных с интенсификацией белкового и креатинового обмена, например, при больших физических нагрузках, инфекционных заболеваниях (в том числе септических состояниях), восстановлении после травм, заживлении ран при хирургических вмешательствах, ожогах, а также у детей в период интенсивного роста и некоторых наследственных заболеваниях, сопровождающихся дефицитом ферментов синтеза аргинина, аргинин становится незаменимым и обязательно должен в необходимых количествах поступать в организм извне с пищей, напитками, биодобавками или в виде инфузий. Здесь уместно отметить, что пероральный путь поступления аргинина является менее эффективным в сравнении с инфузиями, так как эта высокополярная аминокислота плохо всасывается в кишечнике, ее значительная часть легко метаболизируется микрофлорой кишечника и не поступает в кровяное русло. Всасывание аргинина из пищеварительной системы особенно снижается при различных дисбактериозах, сопровождающихся уменьшением рН. Поэтому в последнее время для перорального потребления аргинина предлагаются различные его производные (L-Arginine Alpha-Ketoglutarate, Arginine Ethyl Ester и др.), которые почти полностью всасываются в кровяное русло [6,8], однако инфузия аргинина по прежнему остается наиболее эффективным путем доставки его в организм.

L-аргинин используется в организме как строительный и энергетический материал, а также функционирует как сигнальная молекула. Он содержит положительно заряженную R-группу и в больших количествах входит в состав основных белков. Среди них ядерные белки протамины и гистоны, играющие исключительную роль в формировании структуры и регуляции функции генов, а также пептиды, такие как тафцин – тетрапептид с выраженным иммуномодуляторным действием. Поэтому при дефиците аргинина в первую очередь снижается синтез и уменьшается содержание этих белков, пептидов и полиаминов, например, в богатой ими сперме. Из аргинина, как глюкогенной аминокислоты, образуется D-глюкоза и гликоген. Аргинин стимулирует образование ряда цитокинов, а также высвобождение из гипофиза гормона роста и пролактина, а из поджелудочной железы глюкагона и инсулина; активирует углеводный и липидный обмен [13,19,20,25].

Разностороннее участие аргинина в метаболизме, определяет широкий спектр его терапевтического действия и эффективность использования в составе диетических добавок. Он увеличивает мышечную массу, уменьшает объем жировой ткани, способствует нормализации состояния соединительной ткани. Аргинин, а также богатые им пептиды и белки, снижают рост патогенной микрофлоры, что связано с высоким положительным зарядом его боковой цепи и отрицательным зарядом внешней стенки бактерий, который значительно превышает подобный заряд в мембранах теплокровных. Являясь предшественником важных компонентов соединительной ткани: пролина и оксипролина, аргинин способствует заживлению ран, в том числе гнойных. Регулируя тонус гладкой мускулатуры, проницаемость и микроциркуляцию сосудов, аргинин снижает кровяное давление и ускоряет кровоток, что облегчает доставку кислорода к миокарду, головному мозгу, конечностям и др. органам. Аргинин противодействует тромбообразованию, снижает уровень холестерина в крови и предупреждает развитие атеросклероза. У людей с гиперхолестеринемией, атеросклерозом и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, включая ишемический инсульт, а также животных, у которых моделировались эти состояния, длительное пероральное поступление или периодические инфузии L-аргинина существенно улучшают функцию эндотелия и клиническую симптоматику. Аргинин участвует в коммуникации между нервными клетками и улучшает память, увеличивает бодрость и снижает депрессию, укрепляет иммунитет, повышает резистентность к инфекционным заболеваниям и ранним стадиям канцерогенеза, скорость заживления ран, а также повышает потенцию и стимулирует сперматогонез. Положительный эффект инфузии аргинина отмечается при сепсисе. Через превращение в орнитиновом цикле аргинин участвует в обезвреживании аммиака в организме. Он снижает частоту апоптоза у клеток, подвергнутых повреждающим воздействиям. Потребности в аргинине возрастают при старении и физических нагрузках [1,7,11,14,17,18,21,23,25] .

Такую многоплановость действия аргинина многие исследователи относят к его способности при введении в организм усиливать синтез оксида азота [4,11,14,16]. Физиологические и токсические функции NO реализуются в результате сложных химических превращений, основными участниками которых являются переходные металлы, тиолы, кислород, супероксид и другие радикалы. При этом реализуются прямые (через образование нитрозотиолов, нитрозильных комплексов гемового и негемового железа) и опосредованные другими активными формами азота пути действия NO; через реакции S- и N-нитрозирования, нитрования, окисления, дезаминирования и другие осуществляется регуляция метаболических процессов или реализуются токсические эффекты [2]. Однако очевидность усиления синтеза NO при поступлении в организм аргинина представляется довольно спорной и не всегда подтверждается экспериментально [12,26].

Трудно представить, что NO-синтазы, имеющие высокое сродство к аргинину (Km у них находится в пределах микромолярных величин) испытывают в нем недостаток, поскольку его внутриклеточные концентрации исчисляются в миллимолях. Однако, в последнее время показано, что введение аргинина может приводить к усилению синтеза NO в организме. Этот феномен, известный как «аргининовый парадокс», осуществляется при наличии в клетках определенных концентраций свободного асимметричного диметиларгинина (ADMA), который в условиях in vivo конкурирует с аргинином на уровне транспортера Y+ и/или NO-синтаз. При высоких уровнях ADMA, угнетающих эндотелиальную NO-синтазу, введение L-аргинина восстанавливает ее активность, нормализует функцию эндотелия и сосудистый тонус [4,15]. С другой стороны, направленность действия аргинина, опосредуемая через ускорение ендогенного синтеза NO, может быть различной в зависимости от состояния организма. Так, при выраженных воспалительных процессах, которые сопутствуют тяжело протекающим заболеваниям, таким как cиндром системной воспалительной реакции и органной недостаточности, сепсис, атеросклероз, а также сопровождаются индукцией соответствующей формы NO-синтазы и развитием оксидативного стресса, введение аргинина может не только не оказать терапевтического действия на больного, но даже ухудшить его состояние за счет гиперпродукции пероксинитрита и других токсичных реактивных форм азота [5,26]

В большинстве работ, в которых исследовали in vivo влияние аргинина, о синтезе NO судили по косвенным показателям. В настоящей работе нами c помощью метода ЭПР проведено прямое количественное определение интенсивности образования NO в печени крыс, а также исследовано количество стабильных метаболитов оксида азота ( NO2-и NO3-) в сыворотке крови и моче.

Материалы и методы. Исследования проводили на 36 крысах линии Вистар массой 230-250 г. За неделю до начала экспериментов из рациона питания животных были исключены овощи для уменьшения нитритно-нитратной нагрузки. Проведено 3 серии экспериментов (в каждой группе – по 6 крыс).

В качестве экзогенного источника аргинина использовали 4,2% раствор аргинина гидрохлорида, предоставленный фармацевтическим предприятием «Юрия Фарм» (Украина).

Эксперимент №1: контрольная группа – крысам внутрибрюшинно вводили 2 мл физ.раствора, опытная группа – внутрибрюшинно вводили 4,2% раствор аргинина гидрохлорида из расчета 8 мл/кг массы тела (L-аргинин – 336 мг/кг). Сразу после введения животные были посажены в мочесборные камеры на 1 сутки. В суточной моче определяли диурез, содержание нитритов, нитратов и креатина.

Эксперимент №2: контрольная группа: внутрибрюшинно вводили 2 мл физ. раствора; опытная группа – внутрибрюшинно вводили 4,2% раствор аргинина гидрохлорида из расчета 8 мл/кг массы тела (L-аргинин – 336 мг/кг). Через 2 ч после введения животных декапитировали, отбирали образцы крови и ткани печени. В сыворотке крови определяли содержание нитритов, нитратов и креатина. Образцы ткани печени замораживали в жидком азоте и проводили ЭПР-спектроскопическое исследование для определения концентрации NO в нитрозильных комплексах.

Эксперимент №3. Для прямого количественного определения интенсивности образования NO в тканях органов использовали ловушку NO: за 30 минут до забоя внутрибрюшинно вводили 2,5 мл водного раствора диэтилдитиокарбомата натрия (ДТК) из расчета 500 мг/кг массы тела и подкожно – раствор цитрата двухвалентного железа (сульфат железа 37,5 мг/кг + цитрат натрия 187,5 мг/кг); контрольная группа – вводили ловушку NO (как описано выше), опытная группа: -внутрибрюшинно вводили 4,2% раствор аргинина гидрохлорида из расчета 8 мл/кг массы тела (L-аргинин – 336 мг/кг).Через 1,5 ч животным опытной группы вводили ловушку NO и через 30 мин декапитировали. Образцы ткани печени замораживали в жидком азоте и проводили ЭПР-спектроскопическое исследование для определения NO, захваченного ловушкой.

Спектр ЭПР регистрировали на радиоспектрометре “Varian E 109” (США) при температуре жидкого азота. Осаждение белка в сыворотке крови и моче проводили путем добавления к 2 мл образца 0,5 мл насыщенного Ва(ОН)₂ и 0,2 мл 20% ZnSO₄ и удаления сформировавшегося осадка центрифугированием.

При определении нитрита к 200 мкл исследуемого образца добавляли 20 мкл конц. НСL и 20 мкл 37,5 мМ водного раствора сульфаниловой кислоты. Через 3 мин добавляли 20 мкл 0,1%-ного водного раствора н-1-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида (NED). Через 40 мин измеряли оптическую плотность при 540 нм.

Для определения нитрата его восстанавливали в нитрит путем пропускания проб через кадмиевые колонки (0,5 Х 2,5-3,0 см). Скорость эллюирования не превышала 3-5 см³/мин. Восстановительная способность кадмиевых колонок, определяемая с использованием стандартного раствора нитрата, составляла более 90% и учитывалась при расчетах. Подготовка колонок к работе включала последовательную промывку (по 3 мл) водой и аммиачным буфером рН 9,8 (указать молярность). Затем в колонки последовательно вносили 1 мл исследуемого р-ра образца, 0,25 мл аммиачного буфера рН 9,8 (такой же молярности ?) и 0,75 мл дист. воды. В эллюате определяли содержание нитрита.

Креатинин в образцах сыворотки и мочи определяли по реакции с пикриновой кислотой с использованием набора реактивов «Фелисит».

Статистический анализ данных проводили по t-критерию Стъюдента.

Результаты и их обсуждение. После введения крысам раствора аргинина суммарное содержание нитритов и нитратов в сыворотке крови и моче увеличилось соответственно в 1,6 и 2 раза (табл. 1). Содержание нитратов и нитритов в исследуемых образцах контрольных животных связано в большей степени с поступлением этих соединений с едой, однако значительное увеличение их количества после введения аргинина свидетельствует об интенсификации эндогенного синтеза NO.

Для прямого количественного определения скорости образования NO в организме была введена ловушка NO – комплекс ДТК-Fe²⁺. Ловушка способна накапливаться в тканях и связывать как свободный NO, так и перехватывать его с эндогенных нитрозильных комплексов. При этом образуется мононитрозильный комплекс ДТК-Fe²⁺-NO с характерным триплетным сигналом ЭПР (g_II=2,04, g_┴= 2,02, g_ср=2,03, рис.1). В отличие от эндогенных комплексов NO, комплекс «ловушка- NO» стабильный в биологической среде при действии кислорода и других окислителей. Поэтому интенсивность соответствующего сигнала ЭПР характеризует интенсивность синтеза NO в тканях. Под действием препарата «Тивортин» количество NO, зафиксированного ловушкой в ткани печени за 1 час, увеличилось на 26% (табл.2). При количественной оценке интенсивность образования NO составил 0,87 и 1,1 мкмоль/(г·час) соответственно у контрольных и опытных животных. Полагается, что концентрация NO в тканях контрольных животных находится на уровне сотни нмоль. Сравнительно большое количество NO, зарегистрированное в ткани печени интактных животных, объясняются действием значительного количества введенного двухвалентного железа, необходимого для достижения требуемой концентрации ловушки в тканях. Если учесть это влияние, то скорость образования NO в печени крыс под действием препарата «Тивортин» оценивается как 0,3 мкмоль/(г·час), что приблизительно в 2 раза больше, чем у интактных животных.

Введение препарата, содержащего L-аргинин, на 13% усиливается сигнал ЭПР митохондриальных свободных радикалов и на 60% сигнал Mn²⁺-центров в печени, что указывает на усиление электроннотранспортных процессов. Увеличивается на 30% интенсивность сигнала Cu²⁺-центров (каталитические центры фермента супероксиддизмутазы), что свидетельствует об усилении антирадикальных процессов.

Выводы

1. Введение крысам препарата «Тивортин», содержащего L-аргинин, приводит к усилению образования оксида азота в организме, что сопровождается увеличением образования NO в ткани печени, а также суммарного содержания его стабильных метаболитов (NO₂^– и NO₃^–) в плазме крови и моче.

2. По данным ЭПР-спектроскопии введение крысам препарата «Тивортин» усиливает функциональную активность митохондрий.