Незважаючи на значний прогрес в підходах до пошуку терапевтичних сполук, існує довгий перелік захворювань, які не піддаються лікуванню звичайними низькомолекулярними лікарськими засобами. У випадку деяких патологій, синтез складних білків зі специфічними біологічними функціями необхідно здійснювати безпосередньо в клітинах пацієнта. Деякі складні білкові молекули чи навіть клітинні терапевтичні засоби набагато ефективніші, коли виробляються безпосередньо в організмі людини. Окрім того, епідемії у високомобільному глобалізованому світі вимагають економічно ефективного та масштабного виробництва складних вакцин, які можливо оперативно адаптовувати до швидкозмінних антигенів збудника.
ЮРіЯ-ФАРМ розробляє генотерапію наступного покоління, засновану на здатних до самоампліфікації мРНК. Ці рішення забезпечують експресію імуногенних та неімуногенних РНК і білків в клітинах людського організму. Розроблена нами технологічна платформа має ряд переваг перед сучасними рішеннями:
- експресія імуногенних та неімуногенниз білків in situ;
- експресія тривалістю в місяць після введення однієї дози;
- можливість титрування терапії для досягнення необхідного фармакологічного ефекту;
- різні можливості для дозування.
Наша платформа має усі технічні можливості, необхідні для доклінічного виробництва та розробки терапевтичних засобів на основі мРНК.
мРНК-експресуючі вектори
Терапевтичні кількості білка, тривалість і клітинна специфічність експресії, фармакокінетичний профіль – усе кодується та контролюється нуклеотидною послідовністю трансльованих і нетрансльованих ділянок мРНК.
Наша оптимізована векторна бібліотека містить кілька експериментально підтверджених модулів, у тому числі:
- оптимізовані послідовності, що фланкують промотор для T7 РНК-полімерази;
- 5’UTR послідовності для оптимізованої Cap-залежної та cap-незалежної трансляції (за допомогою IRES);
- 3’UTR послідовності для контролю субклітинної локалізації, клітинно-специфічної експресії, функціонального напіврозпаду тощо;
- бібліотеку послідовностей для котранскрипційного поліаденілювання;
- допоміжні елементи (аптамери, рибозими).
Власна платформа генерації векторів PUZZLEX дозволяє безшовно збирати бібліотеку та замінювати будь-який модуль, необхідний для оптимальної функціональності РНК.
Наразі ми працюємо над технологією нового покоління мРНК векторів, здатних генерувати кільцеву РНК.
Усі вектори оптимізовані для утворення великої кількості копій, стабільного розмноження в E. coli та придатні для збирання довгих (до 12 кб) конструкцій.
Оптимізований процес виробництва та очищення мРНК
Процес отримання мРНК простіший за будь-який типовий варіант виробництва рекомбінантних білків. Проте забезпечення економічно ефективного виробництва РНК вимагає багатофакторної оптимізації з одночасним контролем складного профілю домішок.
У ЮРіА-ФАРМ ми провели масштабні дослідження характеристик цього процесу, щоб визначити простір оптимізації для найбільш критичних етапів:
- лінеаризація плазміди;
- транскрипція In vitro;
- мультимодальна хроматографічна очистка;
- хроматографічна очистка на основі гідрофобної взаємодії;
- ультрафільтрація;
- ліофілізація лікарської речовини.
Ці характеристики разом із застосуванням виробничої платформи дозволяють передбачувано змінбвати та контролювати критичні параметри для дизайну процесу, оптимізованого під вимоги продукту та проекту.
Ми регулярно здійснюємо виробництво та очищуємо продукцію доклінічного класу в міліграмовому масштабі для проведення досліджень на тваринах in vitro та in vivo.
Formulation technologies
Наше стратегічне партнерство з Precision NanoSystems Inc (Канада) дозволяє «Юрія-Фарм» виконувати розробку формуляцій наноносіїв, включаючи формуляції на основі LNP/LPX/ліпосом для РНК і ДНК API, використовуючи масштабовану та перевірену GMP технологію тороїдального змішувача NXGEN®. Крім того, вчені-розробники ТОВ «Юрія-Фарм» мають досвід створення формуляцій полімерних наночастинок для доставки нуклеїнових кислот та низькомолекулярних сполук.
Наші виробничі можливості варіюють від сотень мікролітрів до багатомілілітрових формуляцій. Це дозволяє забезпечувати розробку та доклінічні дослідження формуляцій наноносіїв для терапевтичних засобів на основі нуклеїнових кислот, а також широкого спектру білків, низькомолекулярних API та комбінованацій цих сполук.
Наші власні можливості органічного синтезу та стратегічне співробітництво з партнерами дозволяють запроваджувати нові варіанти хімічної структури ліпідів/ліпідоїдів/полімерів для того, щоб націлювати наноносії та контролювати кінетику вивільнення їх вмісту.
Отримані формуляції далі очищають за допомогою декількох методів, включаючи: діаліз/фільтрацію тангенціальним потоком (TFF) для заміни буфера, видалення домішок за допомогою гель-фільтраційної мультимодальної хроматографії, видалення розчинника та концентрування за допомогою TFF і, нарешті, стерильну фільтрацію.
Наша платформа супроводжується низкою аналітичних інструментів, які дозволяють характеристику, контроль якості та розробку виробничого процесу для формуляцій наноносіїв.
Аналітична платформа
Щоб забезпечити відкриття та розробку виробничого процесу для ліків на основі мРНК ми впровадили групу спеціально розроблених та попередньо кваліфікованих аналітичних методів. Вони дозволяють здійснювати поглиблену характеристику та контроль якості лікарських субстанцій на основі мРНК та формуляцій LPX/LNP, щоб забезпечити надійне картування звʼязків між структурою та активністю (SAR) речовини та суворий контроль над специфікацією матеріалу для застосування в дослідженнях чи доклініці.
Усі методи в аналітичній панелі були розроблені відповідно до методології quality-by-design і виконуються вченими-аналітиками науково-дослідного центру «Юрія-Фарм», що забезпечує швидкий аналітичний зворотний зв’язок і усуває невизначеність, пов’язану з передачею зразка та довгостроковим зберігання.
Наша аналітична панель налаштована характеристики як лікарських речовин на основі мРНК, так і лікарських засобів, виготовлених на основі LNP/LPX/ліпосом:
- CE-DAD, CE-LIF (ідентифікація, склад, розподіл довжин polyA-хвоста);
- (U)HPLC-UV (ідентифікація, склад, читота);
- (U)HPLC-MS (ефективність кепування, озподіл довжин polyA-хвоста);
- Sanger sequencing (ідентифікація, сиквенування поліА-хвоста);
- RT-qPCR, qPCR (ідентифікація, залишкова pDNA, залишкова E. coli DNA);
- Флуорисцентна спектрометрія (залишкова pDNA, ефективність енкапсуляції, pKa наноносія);
- Люмінометрія (ефективність);
- ELISA (potency, залишкові білки E. coli);
- BLI (potency, залишкові білки E. coli);
- DLS (розмір часток, PDI, дзета-потенциял);
- SEC-TDA (ідентифікація, чистота, розмір часток);
- (U)HPLC-ELSD (визначення ліпідів, ліпідний склад);
- Bioassays (диттєздатність, експресія репортера, потенціал до злиття (DOPE liposomes test).
Також забезпечено всі необхідні стандартні процедури для стерильних ін’єкційних препаратів.
Крім того, науково-дослідний центр ЮРіЯ-ФАРМ володіє додатковими аналітичними можливостями (Nothern Blotting, NGS, проточна цитометрія, олігонуклеотидне картування (LC-MS/MS) тощо), а також повним набором аналітичних інструментів для аналізу білків для підтримки відкриттів та розробки терапевтичних засобів на основі мРНК.